#2. Cytosol Nuclear fractionation protocol [merckmillipore]

 

 

 

Cytosolic, Nuclear Protein harvest

NucBuster tm protein Extaction kit

Kit : merckmillipore(cat.71183-3)

 

(NucBuster ^TM protein Extaction kit의 양이 충분한지 확인 후 실험에 들어간다. 모자라면 재 주문)

 

Day 1.  Cell seeding 

1.      Cell을 well당 일정한 양을 seeding후 안정화

 

Day 2. compounds treat and protein harvest

2.     Media change(MC) (0.1% FBS or OPTI MEM)로 stabilization 후 compounds 처리

3.     stimulator를 처리해 준 후 0.5-1H 후 grows media(GM) suction 해 주고 1ｘPBS로 한 번 wash해 준다.

4.     다시 1ｘPBS를 well에 넣어 준 후 스크래퍼나 tip 으로 cell을 긁어서 모두 tube로 담아 5000RPM, 5min, 4  에서 centrifuge

5.     tube안의 supernatant를 1ml tip으로 제거해 주고 다시 1ｘPBS로 wel에 남은 cell을 긁어서 tube에 넣고 5000RPM, 5min, 4  에서 centrifuge

6.     tube안의 supernatant를 1ml tip으로 제거해 주고 tube 주변에 남은 supernatant 모두를 제거해 주기 위해 다시 한번 더 5000RPM, 3min, 4  에서 centrifuge

7.     200λ pipet으로 supernatant를 완전히 제거해 주면 pellet이 남아있는 것이 보이는데 이것이 원하는 protein을 뽑을 수 있는 material

8.     NucBuster tm protein Extaction kit의 Reagent1을 75λ tube 에 넣어주고 (stop-> 급속냉각 후 deep-freezer) voltex를 강하게 15s 해준다. 경우에 따라 pellet이 완전히 single cell로 떨어질 때까지 약 30s 동안 강하게 voltex를 해준다.

9.     Ice 5min 후 다시 voltex 15s 강하게 해 준 후 1,6000ｘg (?RPM), 5min, 4  에서 centrifuge (centrifuge돌아갈 동안 cyto, Nu tube labeling)

10.   Pellet 은 그대로 두고 상등액만 cyto tube로 옮겨 담는다.

11.   Nuclear에 영향을 미칠지 모르는 남아있는 상등액을 모두 제거하기 위해 cold PBS 500λ정도를 넣고 약간 흔들어 준 후 1,6000ｘg, 5min, 4  에서 centrifuge

12.   PBS를 제거해 주고 다시 잔류하는 PBS제거를 위해 다시 한 번 centrifuge (이 중간에 1tube당 Reagent 2를 75λ + 1λ 100ｘProtease inhibitor cocktail, 1λ 100mM DTT 로 tube 수를 계산하여 만들어 둔다.)

13.   supernatant제거 후 만들어둔 reagent 2를 각 tube당 76λ씩 넣어주고 voltex를 강하게 15s 해준다. 경우에 따라 pellet이 완전히 single cell로 떨어질 때까지 약 30s 동안 강하게 voltex를 해준다.

14.   9, 10번을 반복하여 Nuclear를 뽑는다.

15.   각 tube를 deep-frezeer에 보관한다. –나중에 정량값이 나오면 sheet를 실험노트에 붙이고 No.__를 tube에 적어둔다.