'ㄴMethods'에 해당되는 글 2건

Cytosolic, Nuclear Protein harvest

NucBuster tm protein Extaction kit

Kit : merckmillipore(cat.71183-3)

(NucBuster ^TM protein Extaction kit의 양이 충분한지 확인 후 실험에 들어간다. 모자라면 재 주문)

Day 1.  Cell seeding 

1.      Cell을 well당 일정한 양을 seeding후 안정화

Day 2. compounds treat and protein harvest

2.     Media change(MC) (0.1% FBS or OPTI MEM)로 stabilization 후 compounds 처리

3.     stimulator를 처리해 준 후 0.5-1H 후 grows media(GM) suction 해 주고 1ｘPBS로 한 번 wash해 준다.

4.     다시 1ｘPBS를 well에 넣어 준 후 스크래퍼나 tip 으로 cell을 긁어서 모두 tube로 담아 5000RPM, 5min, 4  에서 centrifuge

5.     tube안의 supernatant를 1ml tip으로 제거해 주고 다시 1ｘPBS로 wel에 남은 cell을 긁어서 tube에 넣고 5000RPM, 5min, 4  에서 centrifuge

6.     tube안의 supernatant를 1ml tip으로 제거해 주고 tube 주변에 남은 supernatant 모두를 제거해 주기 위해 다시 한번 더 5000RPM, 3min, 4  에서 centrifuge

7.     200λ pipet으로 supernatant를 완전히 제거해 주면 pellet이 남아있는 것이 보이는데 이것이 원하는 protein을 뽑을 수 있는 material

8.     NucBuster tm protein Extaction kit의 Reagent1을 75λ tube 에 넣어주고 (stop-> 급속냉각 후 deep-freezer) voltex를 강하게 15s 해준다. 경우에 따라 pellet이 완전히 single cell로 떨어질 때까지 약 30s 동안 강하게 voltex를 해준다.

9.     Ice 5min 후 다시 voltex 15s 강하게 해 준 후 1,6000ｘg (?RPM), 5min, 4  에서 centrifuge (centrifuge돌아갈 동안 cyto, Nu tube labeling)

10.   Pellet 은 그대로 두고 상등액만 cyto tube로 옮겨 담는다.

11.   Nuclear에 영향을 미칠지 모르는 남아있는 상등액을 모두 제거하기 위해 cold PBS 500λ정도를 넣고 약간 흔들어 준 후 1,6000ｘg, 5min, 4  에서 centrifuge

12.   PBS를 제거해 주고 다시 잔류하는 PBS제거를 위해 다시 한 번 centrifuge (이 중간에 1tube당 Reagent 2를 75λ + 1λ 100ｘProtease inhibitor cocktail, 1λ 100mM DTT 로 tube 수를 계산하여 만들어 둔다.)

13.   supernatant제거 후 만들어둔 reagent 2를 각 tube당 76λ씩 넣어주고 voltex를 강하게 15s 해준다. 경우에 따라 pellet이 완전히 single cell로 떨어질 때까지 약 30s 동안 강하게 voltex를 해준다.

14.   9, 10번을 반복하여 Nuclear를 뽑는다.

15.   각 tube를 deep-frezeer에 보관한다. –나중에 정량값이 나오면 sheet를 실험노트에 붙이고 No.__를 tube에 적어둔다.

Materials and Methods

#1. Cell culture 

Media (10% FBS in media, welgene), 1 X PBS, pipet, pipet aid, cleanbench, tip(1000ul, 200ul, 10ul), trypsin(welgene), 15ml tube or 50ml tube(SPL), dish(Nunc)

1   FBS 와 Media를 thermostat (37도) 에 넣어서 미리 heat (약 20분)    2   Cleanbench ON (UV off, light ON, Fan turn on), 필요한 멸균된 pipet이나 tip등이 충분한지 확인하고 미리 cleanbench안에 넣어둔다   3   Cleanbench를 70% EtOH 묻힌 티슈로 잘 닦는다   4   주변 정리(FBS, Media 등 화염멸균 후 Cleanbench안에 넣기)   5   alcohol lamp에 불 붙이기   6   CO2 incubator에서 dish 꺼내어 cell을 현미경으로 관찰   7   cell에 이상이 없으면 현미경 스위치를 끈 후 dish를 클린벤치로 가져간다   8   포셋을 이용해 tip을 꺼내어 suction기에 끼운 후 dish안에 있는 media suction     9   media가 완전히 suction되면 tip은 빼서 버리고 suction기 전원 off.   10   pipet aid 이용해 1X PBS 5ml를 dish 에 넣고(cell이 떨어지지 않도록 가장자리로 PBS를 넣어준다) 골고루 handling 해 준 후 다시 suction (dead cell, serum 등이 남아있지 않도록 wash)   11   Dish에 trypsin 0.5ml 넣고 5% CO2 incubator 2~3min   12   cell이 바닥에서 떨어졌는지 현미경으로 확인(2~3분 후)   13   1X PBS 10ml 넣고 pipeting으로 cell을 떼어내 준 후 15ml tube에 담는다    14  15ml tube centrifuge 1200RPM, 3min   15   centriguge​ 하는 시간 동안 new dish 에 labeling(name, date, cell line name, passage...)   16   ​tube가져와서 supernatant throw out, new media 10ml넣고 pipeting ​ ​17   ​cell count  ​ 18  ​원하는 양만큼 new dish에 cell seeding ​ 19  ​혹은 실험해야 하는 거라면 원하는 cell 수로 원하는 plate에 cell seeding

[ 참고 문헌 ]

---

세포배양노트

저자

정출이헌 지음

출판사

월드사이언스 | 2001-08-05 출간

카테고리

과학

책소개

초보자를 위한 세포배양 입문서. 배양실 견학에서부터 세포를 제대...

---

cell 실험을 할 땐 항상 라텍스를 끼고 contamination이 되지 않도록 유의하면서 조심스럽게 실험해야한다

물론 cell 을 항상 조심스럽게 다뤄야 하고, culture 할 때 자극을 많이 주지 않는 것이 결과에 영향을 미치지 않는 방법이다.