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한글 문서 작업시 알아두면 편리한 단축키 정리

1. 한글 문서 작업시 앞 줄 맞추기 단축키: Shift + Tab (앞 줄을 맞추고자 하는 자리에 커서를 놓고)

2. 표 안에서 앞 줄 맞춤 맞추기 단축키: Ctrl + Shift + Tab (앞 줄을 맞추고자 하는 자리에 커서를 놓고)

※ 줄간격

줄간격은 말 그대로 줄과 줄의 간격을 말합니다. 기본 줄간격은 160%이고 0~500% 사이값으로 조절할 수 있습니다.

3. 줄간격 단축키는 줄간격 좁게 Alt + Shift + A / 줄간격 넓게 Alt + Shift + Z

※ 자간

글자와 글자 사이를 자간이라고 하며 기본값은 0%입니다. -50%~50% 사이값으로 조절할 수 있습니다.

4. 자간 단축키는 자간 넓게 Alt + Shift + W /  자간 좁게 Alt + Shift + N 

※ 장평

장평은 글자의 가로세로 비율을 뜻하며 기본값은 100%입니다. 50~200% 사이값으로 조절할 수 있습니다.

5. 장평 단축키는 장으로 Alt + Shift + K / 평으로 Alt + Shift + J

자간과 장평은 글자 모양에 들어가서 조절 가능. 글자 모양 단축키는 Alt + L 

◆ Trans buffer 만들기

Tryptic Soy Agar

1L 만들 때

                Tryptose                                                    17g

                Soytone                                                      3g

                Glucose                                                     2.5g

                Sodium Chloride                                          5g

                Dipotassium Phosphate                            2.5g

                Agar (1.5%)                                                 15g

위의 성분을 증류수 1,000ml에 녹여 pH 7.3±0.2로 조정 후 121°에서 15분간 멸균한다.

200ml 만들 때

                Tryptose                                                   3.4g

                Soytone                                                    0.6g

                Glucose                                                     0.5g

                Sodium Chloride                                          1g

                Dipotassium Phosphate                            0.5g

                Agar (1.5%)                                                  3g

Cytosolic, Nuclear Protein harvest

NucBuster tm protein Extaction kit

Kit : merckmillipore(cat.71183-3)

(NucBuster ^TM protein Extaction kit의 양이 충분한지 확인 후 실험에 들어간다. 모자라면 재 주문)

Day 1.  Cell seeding 

1.      Cell을 well당 일정한 양을 seeding후 안정화

Day 2. compounds treat and protein harvest

2.     Media change(MC) (0.1% FBS or OPTI MEM)로 stabilization 후 compounds 처리

3.     stimulator를 처리해 준 후 0.5-1H 후 grows media(GM) suction 해 주고 1ｘPBS로 한 번 wash해 준다.

4.     다시 1ｘPBS를 well에 넣어 준 후 스크래퍼나 tip 으로 cell을 긁어서 모두 tube로 담아 5000RPM, 5min, 4  에서 centrifuge

5.     tube안의 supernatant를 1ml tip으로 제거해 주고 다시 1ｘPBS로 wel에 남은 cell을 긁어서 tube에 넣고 5000RPM, 5min, 4  에서 centrifuge

6.     tube안의 supernatant를 1ml tip으로 제거해 주고 tube 주변에 남은 supernatant 모두를 제거해 주기 위해 다시 한번 더 5000RPM, 3min, 4  에서 centrifuge

7.     200λ pipet으로 supernatant를 완전히 제거해 주면 pellet이 남아있는 것이 보이는데 이것이 원하는 protein을 뽑을 수 있는 material

8.     NucBuster tm protein Extaction kit의 Reagent1을 75λ tube 에 넣어주고 (stop-> 급속냉각 후 deep-freezer) voltex를 강하게 15s 해준다. 경우에 따라 pellet이 완전히 single cell로 떨어질 때까지 약 30s 동안 강하게 voltex를 해준다.

9.     Ice 5min 후 다시 voltex 15s 강하게 해 준 후 1,6000ｘg (?RPM), 5min, 4  에서 centrifuge (centrifuge돌아갈 동안 cyto, Nu tube labeling)

10.   Pellet 은 그대로 두고 상등액만 cyto tube로 옮겨 담는다.

11.   Nuclear에 영향을 미칠지 모르는 남아있는 상등액을 모두 제거하기 위해 cold PBS 500λ정도를 넣고 약간 흔들어 준 후 1,6000ｘg, 5min, 4  에서 centrifuge

12.   PBS를 제거해 주고 다시 잔류하는 PBS제거를 위해 다시 한 번 centrifuge (이 중간에 1tube당 Reagent 2를 75λ + 1λ 100ｘProtease inhibitor cocktail, 1λ 100mM DTT 로 tube 수를 계산하여 만들어 둔다.)

13.   supernatant제거 후 만들어둔 reagent 2를 각 tube당 76λ씩 넣어주고 voltex를 강하게 15s 해준다. 경우에 따라 pellet이 완전히 single cell로 떨어질 때까지 약 30s 동안 강하게 voltex를 해준다.

14.   9, 10번을 반복하여 Nuclear를 뽑는다.

15.   각 tube를 deep-frezeer에 보관한다. –나중에 정량값이 나오면 sheet를 실험노트에 붙이고 No.__를 tube에 적어둔다.

LB Broth

1)     ddH20 200ml 에 다음과 같이 녹인 후 완전히 녹인다.

2)     Final volume 250ml를 맞춘 후 Autoclave 한다

3)     Antibiotics 의 경우 Autoclave 끝난 뒤 상온에서 잠시 식힌 후

(손을 대었을 때 따뜻한 정도)

Working Concentration 로 넣어주면 된다.

l  Antibiotics

-       Antibiotics Stock 만들기

Ampicilin : 50 mg/ml의 농도로 Ampicilin을 ddH2O에 녹인 후(Vortex),

Syringe filter로 filter 후 멸균 된 1.5ml tube에 520ul씩 aliquot 한 후 냉장고 (-20℃)의 Bacterial culture Antibiotics 상자에 보관한다

Kanamycin : Ampicilin Stock과 동일한 방법으로 Kanamycin을 이용해 만든다.

            현재(2009년 7월) 만들어진 Stock은 50 mg/ml (2500×),

            새로 만드는 Stock은 20 mg/ml (1000×)

LB Agar Plate (250ml, 12~15 plate 분량)

1)     LB Broth를 만든다. (LB Broth의 1) 과정까지)

2)     Bacto Agar 1.5%(3.75g)를 넣은 후 Autoclave 한다.

3)     Antibiotics의 경우 Autoclave 끝난 뒤 상온에서 잠시 식힌 후 (손을 대었을 때 따뜻한 정도) Working Concentration로 넣어주면 된다.

4)     Clean bench 에서 plate에 넣어준 후 고르게 펴지도록 앞뒤  좌우( 로 흔들어 준다.

5)     각 배지에 맞게 plate의 뚜껑에 라벨 해준다.

6)     뚜껑을 열어서 1~2시간을 굳힌다. (1시간 이상 굳혀야 Spreading시 밀리지 않는다)

7)     뚜껑이 바닥으로 오게 하여 랩으로 잘 싸서 4℃ 냉장보관 한다.

8)     만든 날짜를 잘 적어두고 사용하는데 보통 한달 이상 된 것은 사용하지 않는 것이 좋다. Antibiotics의 효율성이 떨어졌을 수도, LB Agar 배지가 말랐을 수도 있기 때문이다.

1.5% agarose gel 만들기

Agarose gel은 전기영동에 쓰이는 것으로 DNA가 이동하는 매질의 역할을 한다.

DNA를 고정하는 능력이 우수하여 DNA를 분자량에 따라 분리해 내기가 용이하다.

Prepare

①     1ｘ TAE Buffer, Ethidium, Agarose

②     전자레인지, 방열장갑, 수평계

Process

1.     과정에 쓰일 물품들을 3차 증류수로 깨끗이 씻어준 후 닦는다(or 말린다).

2.     Buffer를 비커에 넣고 Buffer 무게의 1/100에 해당하는 Agarose를 비커에 넣는다.

è  이 때 gel에 들어가는 성분들의 비율은 다음과 같다.

1X PBS buffer protocol.pdf

1X PBS

in 800 ml of distilled H2O.

8 g ------------------- NaCl

0.2 g ----------------- KCl

1.44 g ---------------- Na2HPO4

0.24 g ---------------- KH2PO4

Adjust the pH to 7.4 with HCl. Add H2O to 1 liter. Sterilize by autoclave.

10X PBS

1.     Dissolve the following in 800ml distilled H2O.

◦80g of NaCl

◦2.0g of KCl

◦14.4g of Na2HPO4

◦2.4g of KH2PO4

1.Adjust pH to 7.4.

2.Adjust volume to 1L with additional distilled H2O.

3.Sterilize by autoclaving.

인산완충식염수 (phosphate buffered saline ; PBS, pH 7.2-7)

PBS는 phosphate buffer로 생물학 관련 실험에서 가장 많이 쓰이는 buffer

Buffer : 완충용액

완충용액은 외부로부터 어느 정도의 산 또는 염기를 가해도 그것들의 영향을 받지 않고, 수소이온농도를 일정하게 유지하려고 하는 용액

버퍼의 선택기준

l  pKa의 값이 6-8사이 정도

l  용액 내에서의 높은 용해성

l  생체막의 투과성

l  염에 의한 영향이 적을 것

l  농도, 온도, 이온들에 의한 영향이 적을 것

l  양이온과의 특별한 반응에 대해 알려진 것이 없어나 전혀 없는 것

l  화학적인 안정성

l  240nm-700nm의 빛에 대해 흡광이 되지 않을 것

l  순도를 높게 얻을 수 있는 것

PBS buffer 가 중요한 이유

1)   이온세기를 맞추어 주기 때문에

우리 몸은 일정농도의 이온농도를 가지고 있습니다. 이온 농도가 너무

높거나 낮을 경우에는 우리 몸의 세포가 삼투막으로 되어 있기 때문에 지나친 물의 흐름이 생겨 세포가 수축하거나 (외부이온농도가 높은 경우) 팽창하여 (외부 이온농도가 낮은 경우) 세포가 파괴될 위험이 있습니다. 우리가 흔히 생리식염수라고 하는 것은 0.9% 의 소금을 녹인 수용액으로 위와 같은 이온농도를 유지하기 위한 것입니다.

2)   완충용액으로의 작용

인산완충용액의 기능을 더한 것. 이러한 완충용약은 우리 몸에서 급격한 pH 변화를 조절해 줍니다. 급격한 pH변화는 여러가지 부분에서 영향을 주지만 대표적으로 단백질 (효소)의 기능이 이러한 pH변화에 민감한 것을 이유로 꼽을 수 있습니다.

따라서 이름도 PBS, phosphate buffered saline 인산 완충용액 + 생리식염수 의 의미인 것입니다.

우리 몸의 이온은 NaCl이 대표적이지만 KCL이 그다음으로 중요한 이온입니다. 따라서 일정비율로 NaCl만이 아니라 KCL도 일부 넣어줍니다.

또 인산완충용액은 Monobasic phosphate와 Dibasic phosphate를 넣어주어야만 완충용액으로서 기능을 합니다. 따라서 먼저 넣어준 양이온에 맞추어 Na2HPO4 10mM, KH2PO4 2mM을 넣어주는 것입니다.

Materials and Methods

#1. Cell culture 

Media (10% FBS in media, welgene), 1 X PBS, pipet, pipet aid, cleanbench, tip(1000ul, 200ul, 10ul), trypsin(welgene), 15ml tube or 50ml tube(SPL), dish(Nunc)

1   FBS 와 Media를 thermostat (37도) 에 넣어서 미리 heat (약 20분)    2   Cleanbench ON (UV off, light ON, Fan turn on), 필요한 멸균된 pipet이나 tip등이 충분한지 확인하고 미리 cleanbench안에 넣어둔다   3   Cleanbench를 70% EtOH 묻힌 티슈로 잘 닦는다   4   주변 정리(FBS, Media 등 화염멸균 후 Cleanbench안에 넣기)   5   alcohol lamp에 불 붙이기   6   CO2 incubator에서 dish 꺼내어 cell을 현미경으로 관찰   7   cell에 이상이 없으면 현미경 스위치를 끈 후 dish를 클린벤치로 가져간다   8   포셋을 이용해 tip을 꺼내어 suction기에 끼운 후 dish안에 있는 media suction     9   media가 완전히 suction되면 tip은 빼서 버리고 suction기 전원 off.   10   pipet aid 이용해 1X PBS 5ml를 dish 에 넣고(cell이 떨어지지 않도록 가장자리로 PBS를 넣어준다) 골고루 handling 해 준 후 다시 suction (dead cell, serum 등이 남아있지 않도록 wash)   11   Dish에 trypsin 0.5ml 넣고 5% CO2 incubator 2~3min   12   cell이 바닥에서 떨어졌는지 현미경으로 확인(2~3분 후)   13   1X PBS 10ml 넣고 pipeting으로 cell을 떼어내 준 후 15ml tube에 담는다    14  15ml tube centrifuge 1200RPM, 3min   15   centriguge​ 하는 시간 동안 new dish 에 labeling(name, date, cell line name, passage...)   16   ​tube가져와서 supernatant throw out, new media 10ml넣고 pipeting ​ ​17   ​cell count  ​ 18  ​원하는 양만큼 new dish에 cell seeding ​ 19  ​혹은 실험해야 하는 거라면 원하는 cell 수로 원하는 plate에 cell seeding

[ 참고 문헌 ]

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세포배양노트

저자

정출이헌 지음

출판사

월드사이언스 | 2001-08-05 출간

카테고리

과학

책소개

초보자를 위한 세포배양 입문서. 배양실 견학에서부터 세포를 제대...

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cell 실험을 할 땐 항상 라텍스를 끼고 contamination이 되지 않도록 유의하면서 조심스럽게 실험해야한다

물론 cell 을 항상 조심스럽게 다뤄야 하고, culture 할 때 자극을 많이 주지 않는 것이 결과에 영향을 미치지 않는 방법이다.