#3. LB Broth/LB Agar Plate

 

LB Broth

1)     ddH20 200ml 에 다음과 같이 녹인 후 완전히 녹인다.

ddDW	250ml	500ml	1000ml	1500ml	2000ml	2500ml	3000ml
Nacl (1%)	2.5g	5g	10g	15g	20g	25g	30g
Tryptone (1%)	2.5g	5g	10g	15g	20g	25g	30g
Yeast extract (5%)	1.25g	2.5g	5g	7.5g	10g	12.5g	15g

 

2)     Final volume 250ml를 맞춘 후 Autoclave 한다

3)     Antibiotics 의 경우 Autoclave 끝난 뒤 상온에서 잠시 식힌 후

(손을 대었을 때 따뜻한 정도)

Working Concentration 로 넣어주면 된다.

 

l  Antibiotics

	Stock Concentration	Working Concentration	250ml/bottle
Ampicilin	50 mg/ml (1000×)	50 ug/ml	250ul
Kanamycin	50 mg/ml (2500×)	20ug/ml	100ul

 

-       Antibiotics Stock 만들기

Ampicilin : 50 mg/ml의 농도로 Ampicilin을 ddH2O에 녹인 후(Vortex),

Syringe filter로 filter 후 멸균 된 1.5ml tube에 520ul씩 aliquot 한 후 냉장고 (-20℃)의 Bacterial culture Antibiotics 상자에 보관한다

Kanamycin : Ampicilin Stock과 동일한 방법으로 Kanamycin을 이용해 만든다.

            현재(2009년 7월) 만들어진 Stock은 50 mg/ml (2500×),

            새로 만드는 Stock은 20 mg/ml (1000×)

 

 

 

LB Agar Plate (250ml, 12~15 plate 분량)

 

1)     LB Broth를 만든다. (LB Broth의 1) 과정까지)

2)     Bacto Agar 1.5%(3.75g)를 넣은 후 Autoclave 한다.

3)     Antibiotics의 경우 Autoclave 끝난 뒤 상온에서 잠시 식힌 후 (손을 대었을 때 따뜻한 정도) Working Concentration로 넣어주면 된다.

4)     Clean bench 에서 plate에 넣어준 후 고르게 펴지도록 앞뒤  좌우( 로 흔들어 준다.

5)     각 배지에 맞게 plate의 뚜껑에 라벨 해준다.

6)     뚜껑을 열어서 1~2시간을 굳힌다. (1시간 이상 굳혀야 Spreading시 밀리지 않는다)

7)     뚜껑이 바닥으로 오게 하여 랩으로 잘 싸서 4℃ 냉장보관 한다.

8)     만든 날짜를 잘 적어두고 사용하는데 보통 한달 이상 된 것은 사용하지 않는 것이 좋다. Antibiotics의 효율성이 떨어졌을 수도, LB Agar 배지가 말랐을 수도 있기 때문이다.