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◆ Trans buffer 만들기

Tryptic Soy Agar

1L 만들 때

                Tryptose                                                    17g

                Soytone                                                      3g

                Glucose                                                     2.5g

                Sodium Chloride                                          5g

                Dipotassium Phosphate                            2.5g

                Agar (1.5%)                                                 15g

위의 성분을 증류수 1,000ml에 녹여 pH 7.3±0.2로 조정 후 121°에서 15분간 멸균한다.

200ml 만들 때

                Tryptose                                                   3.4g

                Soytone                                                    0.6g

                Glucose                                                     0.5g

                Sodium Chloride                                          1g

                Dipotassium Phosphate                            0.5g

                Agar (1.5%)                                                  3g

LB Broth

1)     ddH20 200ml 에 다음과 같이 녹인 후 완전히 녹인다.

2)     Final volume 250ml를 맞춘 후 Autoclave 한다

3)     Antibiotics 의 경우 Autoclave 끝난 뒤 상온에서 잠시 식힌 후

(손을 대었을 때 따뜻한 정도)

Working Concentration 로 넣어주면 된다.

l  Antibiotics

-       Antibiotics Stock 만들기

Ampicilin : 50 mg/ml의 농도로 Ampicilin을 ddH2O에 녹인 후(Vortex),

Syringe filter로 filter 후 멸균 된 1.5ml tube에 520ul씩 aliquot 한 후 냉장고 (-20℃)의 Bacterial culture Antibiotics 상자에 보관한다

Kanamycin : Ampicilin Stock과 동일한 방법으로 Kanamycin을 이용해 만든다.

            현재(2009년 7월) 만들어진 Stock은 50 mg/ml (2500×),

            새로 만드는 Stock은 20 mg/ml (1000×)

LB Agar Plate (250ml, 12~15 plate 분량)

1)     LB Broth를 만든다. (LB Broth의 1) 과정까지)

2)     Bacto Agar 1.5%(3.75g)를 넣은 후 Autoclave 한다.

3)     Antibiotics의 경우 Autoclave 끝난 뒤 상온에서 잠시 식힌 후 (손을 대었을 때 따뜻한 정도) Working Concentration로 넣어주면 된다.

4)     Clean bench 에서 plate에 넣어준 후 고르게 펴지도록 앞뒤  좌우( 로 흔들어 준다.

5)     각 배지에 맞게 plate의 뚜껑에 라벨 해준다.

6)     뚜껑을 열어서 1~2시간을 굳힌다. (1시간 이상 굳혀야 Spreading시 밀리지 않는다)

7)     뚜껑이 바닥으로 오게 하여 랩으로 잘 싸서 4℃ 냉장보관 한다.

8)     만든 날짜를 잘 적어두고 사용하는데 보통 한달 이상 된 것은 사용하지 않는 것이 좋다. Antibiotics의 효율성이 떨어졌을 수도, LB Agar 배지가 말랐을 수도 있기 때문이다.

1.5% agarose gel 만들기

Agarose gel은 전기영동에 쓰이는 것으로 DNA가 이동하는 매질의 역할을 한다.

DNA를 고정하는 능력이 우수하여 DNA를 분자량에 따라 분리해 내기가 용이하다.

Prepare

①     1ｘ TAE Buffer, Ethidium, Agarose

②     전자레인지, 방열장갑, 수평계

Process

1.     과정에 쓰일 물품들을 3차 증류수로 깨끗이 씻어준 후 닦는다(or 말린다).

2.     Buffer를 비커에 넣고 Buffer 무게의 1/100에 해당하는 Agarose를 비커에 넣는다.

è  이 때 gel에 들어가는 성분들의 비율은 다음과 같다.

1X PBS buffer protocol.pdf

1X PBS

in 800 ml of distilled H2O.

8 g ------------------- NaCl

0.2 g ----------------- KCl

1.44 g ---------------- Na2HPO4

0.24 g ---------------- KH2PO4

Adjust the pH to 7.4 with HCl. Add H2O to 1 liter. Sterilize by autoclave.

10X PBS

1.     Dissolve the following in 800ml distilled H2O.

◦80g of NaCl

◦2.0g of KCl

◦14.4g of Na2HPO4

◦2.4g of KH2PO4

1.Adjust pH to 7.4.

2.Adjust volume to 1L with additional distilled H2O.

3.Sterilize by autoclaving.

인산완충식염수 (phosphate buffered saline ; PBS, pH 7.2-7)

PBS는 phosphate buffer로 생물학 관련 실험에서 가장 많이 쓰이는 buffer

Buffer : 완충용액

완충용액은 외부로부터 어느 정도의 산 또는 염기를 가해도 그것들의 영향을 받지 않고, 수소이온농도를 일정하게 유지하려고 하는 용액

버퍼의 선택기준

l  pKa의 값이 6-8사이 정도

l  용액 내에서의 높은 용해성

l  생체막의 투과성

l  염에 의한 영향이 적을 것

l  농도, 온도, 이온들에 의한 영향이 적을 것

l  양이온과의 특별한 반응에 대해 알려진 것이 없어나 전혀 없는 것

l  화학적인 안정성

l  240nm-700nm의 빛에 대해 흡광이 되지 않을 것

l  순도를 높게 얻을 수 있는 것

PBS buffer 가 중요한 이유

1)   이온세기를 맞추어 주기 때문에

우리 몸은 일정농도의 이온농도를 가지고 있습니다. 이온 농도가 너무

높거나 낮을 경우에는 우리 몸의 세포가 삼투막으로 되어 있기 때문에 지나친 물의 흐름이 생겨 세포가 수축하거나 (외부이온농도가 높은 경우) 팽창하여 (외부 이온농도가 낮은 경우) 세포가 파괴될 위험이 있습니다. 우리가 흔히 생리식염수라고 하는 것은 0.9% 의 소금을 녹인 수용액으로 위와 같은 이온농도를 유지하기 위한 것입니다.

2)   완충용액으로의 작용

인산완충용액의 기능을 더한 것. 이러한 완충용약은 우리 몸에서 급격한 pH 변화를 조절해 줍니다. 급격한 pH변화는 여러가지 부분에서 영향을 주지만 대표적으로 단백질 (효소)의 기능이 이러한 pH변화에 민감한 것을 이유로 꼽을 수 있습니다.

따라서 이름도 PBS, phosphate buffered saline 인산 완충용액 + 생리식염수 의 의미인 것입니다.

우리 몸의 이온은 NaCl이 대표적이지만 KCL이 그다음으로 중요한 이온입니다. 따라서 일정비율로 NaCl만이 아니라 KCL도 일부 넣어줍니다.

또 인산완충용액은 Monobasic phosphate와 Dibasic phosphate를 넣어주어야만 완충용액으로서 기능을 합니다. 따라서 먼저 넣어준 양이온에 맞추어 Na2HPO4 10mM, KH2PO4 2mM을 넣어주는 것입니다.