Cytosolic, Nuclear Protein harvest

NucBuster tm protein Extaction kit

Kit : merckmillipore(cat.71183-3)

(NucBuster ^TM protein Extaction kit의 양이 충분한지 확인 후 실험에 들어간다. 모자라면 재 주문)

Day 1.  Cell seeding 

1.      Cell을 well당 일정한 양을 seeding후 안정화

Day 2. compounds treat and protein harvest

2.     Media change(MC) (0.1% FBS or OPTI MEM)로 stabilization 후 compounds 처리

3.     stimulator를 처리해 준 후 0.5-1H 후 grows media(GM) suction 해 주고 1ｘPBS로 한 번 wash해 준다.

4.     다시 1ｘPBS를 well에 넣어 준 후 스크래퍼나 tip 으로 cell을 긁어서 모두 tube로 담아 5000RPM, 5min, 4  에서 centrifuge

5.     tube안의 supernatant를 1ml tip으로 제거해 주고 다시 1ｘPBS로 wel에 남은 cell을 긁어서 tube에 넣고 5000RPM, 5min, 4  에서 centrifuge

6.     tube안의 supernatant를 1ml tip으로 제거해 주고 tube 주변에 남은 supernatant 모두를 제거해 주기 위해 다시 한번 더 5000RPM, 3min, 4  에서 centrifuge

7.     200λ pipet으로 supernatant를 완전히 제거해 주면 pellet이 남아있는 것이 보이는데 이것이 원하는 protein을 뽑을 수 있는 material

8.     NucBuster tm protein Extaction kit의 Reagent1을 75λ tube 에 넣어주고 (stop-> 급속냉각 후 deep-freezer) voltex를 강하게 15s 해준다. 경우에 따라 pellet이 완전히 single cell로 떨어질 때까지 약 30s 동안 강하게 voltex를 해준다.

9.     Ice 5min 후 다시 voltex 15s 강하게 해 준 후 1,6000ｘg (?RPM), 5min, 4  에서 centrifuge (centrifuge돌아갈 동안 cyto, Nu tube labeling)

10.   Pellet 은 그대로 두고 상등액만 cyto tube로 옮겨 담는다.

11.   Nuclear에 영향을 미칠지 모르는 남아있는 상등액을 모두 제거하기 위해 cold PBS 500λ정도를 넣고 약간 흔들어 준 후 1,6000ｘg, 5min, 4  에서 centrifuge

12.   PBS를 제거해 주고 다시 잔류하는 PBS제거를 위해 다시 한 번 centrifuge (이 중간에 1tube당 Reagent 2를 75λ + 1λ 100ｘProtease inhibitor cocktail, 1λ 100mM DTT 로 tube 수를 계산하여 만들어 둔다.)

13.   supernatant제거 후 만들어둔 reagent 2를 각 tube당 76λ씩 넣어주고 voltex를 강하게 15s 해준다. 경우에 따라 pellet이 완전히 single cell로 떨어질 때까지 약 30s 동안 강하게 voltex를 해준다.

14.   9, 10번을 반복하여 Nuclear를 뽑는다.

15.   각 tube를 deep-frezeer에 보관한다. –나중에 정량값이 나오면 sheet를 실험노트에 붙이고 No.__를 tube에 적어둔다.

LB Broth

1)     ddH20 200ml 에 다음과 같이 녹인 후 완전히 녹인다.

2)     Final volume 250ml를 맞춘 후 Autoclave 한다

3)     Antibiotics 의 경우 Autoclave 끝난 뒤 상온에서 잠시 식힌 후

(손을 대었을 때 따뜻한 정도)

Working Concentration 로 넣어주면 된다.

l  Antibiotics

-       Antibiotics Stock 만들기

Ampicilin : 50 mg/ml의 농도로 Ampicilin을 ddH2O에 녹인 후(Vortex),

Syringe filter로 filter 후 멸균 된 1.5ml tube에 520ul씩 aliquot 한 후 냉장고 (-20℃)의 Bacterial culture Antibiotics 상자에 보관한다

Kanamycin : Ampicilin Stock과 동일한 방법으로 Kanamycin을 이용해 만든다.

            현재(2009년 7월) 만들어진 Stock은 50 mg/ml (2500×),

            새로 만드는 Stock은 20 mg/ml (1000×)

LB Agar Plate (250ml, 12~15 plate 분량)

1)     LB Broth를 만든다. (LB Broth의 1) 과정까지)

2)     Bacto Agar 1.5%(3.75g)를 넣은 후 Autoclave 한다.

3)     Antibiotics의 경우 Autoclave 끝난 뒤 상온에서 잠시 식힌 후 (손을 대었을 때 따뜻한 정도) Working Concentration로 넣어주면 된다.

4)     Clean bench 에서 plate에 넣어준 후 고르게 펴지도록 앞뒤  좌우( 로 흔들어 준다.

5)     각 배지에 맞게 plate의 뚜껑에 라벨 해준다.

6)     뚜껑을 열어서 1~2시간을 굳힌다. (1시간 이상 굳혀야 Spreading시 밀리지 않는다)

7)     뚜껑이 바닥으로 오게 하여 랩으로 잘 싸서 4℃ 냉장보관 한다.

8)     만든 날짜를 잘 적어두고 사용하는데 보통 한달 이상 된 것은 사용하지 않는 것이 좋다. Antibiotics의 효율성이 떨어졌을 수도, LB Agar 배지가 말랐을 수도 있기 때문이다.

1.5% agarose gel 만들기

Agarose gel은 전기영동에 쓰이는 것으로 DNA가 이동하는 매질의 역할을 한다.

DNA를 고정하는 능력이 우수하여 DNA를 분자량에 따라 분리해 내기가 용이하다.

Prepare

①     1ｘ TAE Buffer, Ethidium, Agarose

②     전자레인지, 방열장갑, 수평계

Process

1.     과정에 쓰일 물품들을 3차 증류수로 깨끗이 씻어준 후 닦는다(or 말린다).

2.     Buffer를 비커에 넣고 Buffer 무게의 1/100에 해당하는 Agarose를 비커에 넣는다.

è  이 때 gel에 들어가는 성분들의 비율은 다음과 같다.