1X PBS buffer protocol.pdf

1X PBS

in 800 ml of distilled H2O.

8 g ------------------- NaCl

0.2 g ----------------- KCl

1.44 g ---------------- Na2HPO4

0.24 g ---------------- KH2PO4

Adjust the pH to 7.4 with HCl. Add H2O to 1 liter. Sterilize by autoclave.

10X PBS

1.     Dissolve the following in 800ml distilled H2O.

◦80g of NaCl

◦2.0g of KCl

◦14.4g of Na2HPO4

◦2.4g of KH2PO4

1.Adjust pH to 7.4.

2.Adjust volume to 1L with additional distilled H2O.

3.Sterilize by autoclaving.

인산완충식염수 (phosphate buffered saline ; PBS, pH 7.2-7)

PBS는 phosphate buffer로 생물학 관련 실험에서 가장 많이 쓰이는 buffer

Buffer : 완충용액

완충용액은 외부로부터 어느 정도의 산 또는 염기를 가해도 그것들의 영향을 받지 않고, 수소이온농도를 일정하게 유지하려고 하는 용액

버퍼의 선택기준

l  pKa의 값이 6-8사이 정도

l  용액 내에서의 높은 용해성

l  생체막의 투과성

l  염에 의한 영향이 적을 것

l  농도, 온도, 이온들에 의한 영향이 적을 것

l  양이온과의 특별한 반응에 대해 알려진 것이 없어나 전혀 없는 것

l  화학적인 안정성

l  240nm-700nm의 빛에 대해 흡광이 되지 않을 것

l  순도를 높게 얻을 수 있는 것

PBS buffer 가 중요한 이유

1)   이온세기를 맞추어 주기 때문에

우리 몸은 일정농도의 이온농도를 가지고 있습니다. 이온 농도가 너무

높거나 낮을 경우에는 우리 몸의 세포가 삼투막으로 되어 있기 때문에 지나친 물의 흐름이 생겨 세포가 수축하거나 (외부이온농도가 높은 경우) 팽창하여 (외부 이온농도가 낮은 경우) 세포가 파괴될 위험이 있습니다. 우리가 흔히 생리식염수라고 하는 것은 0.9% 의 소금을 녹인 수용액으로 위와 같은 이온농도를 유지하기 위한 것입니다.

2)   완충용액으로의 작용

인산완충용액의 기능을 더한 것. 이러한 완충용약은 우리 몸에서 급격한 pH 변화를 조절해 줍니다. 급격한 pH변화는 여러가지 부분에서 영향을 주지만 대표적으로 단백질 (효소)의 기능이 이러한 pH변화에 민감한 것을 이유로 꼽을 수 있습니다.

따라서 이름도 PBS, phosphate buffered saline 인산 완충용액 + 생리식염수 의 의미인 것입니다.

우리 몸의 이온은 NaCl이 대표적이지만 KCL이 그다음으로 중요한 이온입니다. 따라서 일정비율로 NaCl만이 아니라 KCL도 일부 넣어줍니다.

또 인산완충용액은 Monobasic phosphate와 Dibasic phosphate를 넣어주어야만 완충용액으로서 기능을 합니다. 따라서 먼저 넣어준 양이온에 맞추어 Na2HPO4 10mM, KH2PO4 2mM을 넣어주는 것입니다.

Materials and Methods

#1. Cell culture 

Media (10% FBS in media, welgene), 1 X PBS, pipet, pipet aid, cleanbench, tip(1000ul, 200ul, 10ul), trypsin(welgene), 15ml tube or 50ml tube(SPL), dish(Nunc)

1   FBS 와 Media를 thermostat (37도) 에 넣어서 미리 heat (약 20분)    2   Cleanbench ON (UV off, light ON, Fan turn on), 필요한 멸균된 pipet이나 tip등이 충분한지 확인하고 미리 cleanbench안에 넣어둔다   3   Cleanbench를 70% EtOH 묻힌 티슈로 잘 닦는다   4   주변 정리(FBS, Media 등 화염멸균 후 Cleanbench안에 넣기)   5   alcohol lamp에 불 붙이기   6   CO2 incubator에서 dish 꺼내어 cell을 현미경으로 관찰   7   cell에 이상이 없으면 현미경 스위치를 끈 후 dish를 클린벤치로 가져간다   8   포셋을 이용해 tip을 꺼내어 suction기에 끼운 후 dish안에 있는 media suction     9   media가 완전히 suction되면 tip은 빼서 버리고 suction기 전원 off.   10   pipet aid 이용해 1X PBS 5ml를 dish 에 넣고(cell이 떨어지지 않도록 가장자리로 PBS를 넣어준다) 골고루 handling 해 준 후 다시 suction (dead cell, serum 등이 남아있지 않도록 wash)   11   Dish에 trypsin 0.5ml 넣고 5% CO2 incubator 2~3min   12   cell이 바닥에서 떨어졌는지 현미경으로 확인(2~3분 후)   13   1X PBS 10ml 넣고 pipeting으로 cell을 떼어내 준 후 15ml tube에 담는다    14  15ml tube centrifuge 1200RPM, 3min   15   centriguge​ 하는 시간 동안 new dish 에 labeling(name, date, cell line name, passage...)   16   ​tube가져와서 supernatant throw out, new media 10ml넣고 pipeting ​ ​17   ​cell count  ​ 18  ​원하는 양만큼 new dish에 cell seeding ​ 19  ​혹은 실험해야 하는 거라면 원하는 cell 수로 원하는 plate에 cell seeding

[ 참고 문헌 ]

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세포배양노트

저자

정출이헌 지음

출판사

월드사이언스 | 2001-08-05 출간

카테고리

과학

책소개

초보자를 위한 세포배양 입문서. 배양실 견학에서부터 세포를 제대...

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cell 실험을 할 땐 항상 라텍스를 끼고 contamination이 되지 않도록 유의하면서 조심스럽게 실험해야한다

물론 cell 을 항상 조심스럽게 다뤄야 하고, culture 할 때 자극을 많이 주지 않는 것이 결과에 영향을 미치지 않는 방법이다.